Skip to content

preparaty zurawinowe

3 miesiące ago

558 words

Pierwotne hepatocyty izolowano stosując 2-etapowy protokół perfuzyjny oparty na wcześniejszej metodzie (70). Analiza mikromacierzy i analiza bioinformatyczna. Myszy Pml-WT i -KO męskie 129sv karmiono oczyszczoną dietą kontrolną (TD.08806, Harlan) i tkankę wątroby zebrano w wieku 32. 35 tygodni po 6- do 8-godzinnym głodzeniu (9 rano do 3. 5 pm) w celu uniknięcia skutków bezpośredniego spożycia pokarmu. Całkowity RNA z tkanki wątroby ekstrahowano za pomocą Trizol (Invitrogen), a następnie oczyszczano RNA i trawiono DNA przy użyciu zestawu RNeasy Kit (QIAGEN). Liniową amplifikację RNA przeprowadzono za pomocą zestawu Ovation Kit (Nugen), a znakowany cDNA zastosowano do mikromacierzy oligonukleotydowych (Affymetrix). Pliki DAT Affymetrix zostały przetworzone przy użyciu systemu operacyjnego Affymetrix Gene Chip (GCOS) w celu utworzenia plików .CEL. Jakość skanowanych obrazów tablicowych została określona na podstawie wartości tła, procentu obecnych połączeń, współczynników skalowania i 3. 5. stosunek P-aktyny i GAPDH przy użyciu pakietów Bioconductor R (71) Wysokiej jakości tablice znormalizowano za pomocą solidnego pakietu wieloczipkowych analiz (RMA) (Bioconductor Telease 2.0) z modelami tylko PM. Geny o różnej ekspresji spośród 2 klas zostały zdefiniowane przy użyciu testu t-losowej wariancji. Test t losowo-wariancyjny jest poprawą w stosunku do standardowego oddzielnego testu t, ponieważ pozwala na dzielenie się informacjami wśród genów na temat zmienności wewnątrz klasy bez założenia, że wszystkie geny mają taką samą wariancję (72). Geny uznawano za statystycznie istotne, jeśli ich wartości P były mniejsze niż 0,05. Wartości P dla istotności obliczono na podstawie 10 000 losowych permutacji przy nominalnym poziomie istotności dla każdego testu jednowariantowego 0,05. Dane z mikromacierzy są publicznie dostępne (GEO GSE39220). Analiza wzbogacania GO. Prawdopodobieństwo nadreprezentacji kategorii GO w genach o różnej ekspresji w stosunku do tła wszystkich genów myszy obliczono przy użyciu bazy danych dla adnotacji, wizualizacji i zintegrowanego wykrywania (DAVID). DAVID to internetowa implementacja oprogramowania EASE, które tworzy listę nadreprezentowanych kategorii przy użyciu wielokrotnego, wielokrotnego próbkowania dokładnych testów testu Fishera. Kategorie ontologii GO o wartości P mniejszej niż 0,05 wykazują znaczną nadreprezentację genów ulegających zróżnicowanej ekspresji (73, 74). Analiza promotora. Analizę promotora przeprowadzono przy użyciu narzędzia online ExPlain 3.0 (http://explain.biobase-international.com/) w celu wykrycia nadreprezentowanych miejsc wiązania czynnika transkrypcji. Do analizy wybrano regiony od 1000 bp w górę do 100 pz poniżej miejsca startu transkrypcji każdego genu (zestaw Yes) i losowy zestaw promotorów uzyskanych z genów utrzymywania myszy (No set). Cały cały kręgowiec kręgowców kręgowców z bazy danych TRANSFAC został wykorzystany do skanowania potencjalnych miejsc wiążących (75). Analiza GSEA. GSEA została wykonana przy użyciu GSEA-R, implementacji Bioconductor z GSEA z Broad Institute (61). Analizę GSEA przeprowadzono za pomocą wybranych zestawów genów z bazy danych sygnatur molekularnych z Broad Institute lub przez opracowanie zestawów genów przy użyciu standardowego podejścia. Analizę przeprowadzono przy użyciu 1000 permutacji i klasycznej statystyki. Mierzono znormalizowany wynik wzbogacania (NES) i nominalną wartość P. Utrata przyczepności i hodowle membranowe w podłożu 3D. Do pomiaru ATP w oderwanych komórkach (znormalizowanych pod względem zawartości białka) zastosowano zestaw do oznaczania ATP (Invitrogen). Komórki umieszczano na 6-studzienkowych płytkach powleczonych poli-HEMA . przy gęstości 400 000 komórek na studzienkę. Po 24 godzinach komórki poddano lizie w 1% NP40 (plus inhibitory proteazy) i lizaty znormalizowano na podstawie zawartości białka przy użyciu testu białek BCA (Pierce Biotechnology).
[hasła pokrewne: objawy grzybicy pochwy, oparzenia pierwsza pomoc, objawy sm ]

0 thoughts on “preparaty zurawinowe”