Skip to content

medicus stomatolog

4 miesiące ago

522 words

Lizaty następnie testowano na poziomy ATP zgodnie z protokołem producenta. Aby zmierzyć aktywność kaspazy, zastosowano test kaspazy-GLO (Promega) zgodnie z instrukcjami producenta. W celu wytworzenia acini w hodowli 3D komórki hodowano w odtworzonej błonie podstawnej (Matrigel), jak opisano wcześniej i zgodnie z protokołem z laboratorium Brugge (http://brugge.med.harvard.edu, pozycja 76). Immunofluorescencję acini przeprowadzono jak opisano wcześniej (76). Następujące pierwszorzędowe przeciwciała zastosowano do immunofluorescencji: rozszczepiona kaspaza-3 (9661, technologia sygnalizacji komórkowej) i laminina-5 (mab19562; Millipore). DAPI (Sigma-Aldrich) zastosowano do przeciwdziałania barwieniu jąder. Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym. Całkowity RNA ekstrahowano z komórek za pomocą Trizol (Invitrogen). W celu analizy tkanki wątroby całkowite RNA ekstrahowano za pomocą Trizolu (Invitrogen), a następnie oczyszczano RNA i trawiono DNA przy użyciu zestawu RNeasy Kit (QIAGEN). cDNA uzyskano z Transcriptor (Roche). Sondy TaqMan uzyskano z Applied Biosystems i wybrano w celu uniknięcia wykrycia genomowego DNA. Ampli. kationy były prowadzone w 7900 i systemie PCR w czasie rzeczywistym VIIA7 (Applied Biosystems). Każdą wartość korygowano przy użyciu glukuronidazy B (komórki), p-aktyny (próbki tkanki ludzkiej) lub 36b4 / Rplp0 (tkanki wątroby) jako odniesienia. Western blotting, immunoprecypitacja i immunofluorescencja. Komórki zebrano i ekstrahowano białko, jak opisano wcześniej (77). Doświadczenia z acetylacją przeprowadzono jak opisano wcześniej (39). Pokrótce, komórki transfekowano flagami pcDNA-Flag-PGC1A i Flag-GCN5 w stosunku 4: 1, z pLNCX lub pLNCX- (HA) PMLIV, jak wskazano. Po 24. 48 godzinach komórki poddano lizie w 40 mM Tris (pH 7,6), 150 mM NaCl, mM EDTA, mM MgCl2, 1% Triton X-100, mM orto-wanadanie sodu (Na3VO4), mM NaF mM P-glicerofosforanu, 14 mM nikotynamidu, 400 nM trichostatyny i koktajlu inhibitora proteazy (Hoffmann. La Roche), oczyszczono przez odwirowanie i poddano immunoprecypitacji ze skoniugowanymi z flagą kulkami (Sigma-Aldrich) (w tym samym buforze z 0,1% Triton X-100). Po 2 do 3 godzin perełki przemyto, ponownie zawieszono w Laemmli Loading Buffer (Boston Bioproducts) i gotowano, a supernatant poddano SDS-PAGE. Białka wykrywano stosując królicze poliklonalne przeciwciało anty-PML (Bethyl), przeciwciało anty-PGC1A (H-300, Santa Cruz Biotechnology Inc.), antyacetylo-lizynę (sygnalizacja komórkowa), HSP90 (sygnalizacja komórkowa) i anty. mAb -actin (Sigma-Aldrich). Kompletne nieedytowane bloty dla wszystkich obrazów Western blot w głównej i uzupełniającej postaci są pokazane w suplemencie. W doświadczeniach immunofluorescencyjnych komórki utrwalano w 4% paraformaldehydzie (15 minut), permeabilizowano w 0,1% Triton X-100 (5 minut) i inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc (mysz anty-HA [Covance], królik anty-HA [Sigma] -Aldrich], anty-Flag M2 [Sigma-Aldrich], anty-PML [Bethyl]) po zablokowaniu w 10% surowicy koziej (1 godzina). W celu wykrycia, szkiełka komórkowe inkubowano ze skoniugowanymi przeciwciałami drugorzędowymi, anty-mysim A488, anty-króliczym A594, anty-mysim A647 i / lub anty-króliczym A546 (Invitrogen). Na koniec szkiełka przemyto, inkubowano z DAPI i zamontowano w MOWIOL (Sigma-Aldrich). Analizę konfokalną wykonano w mikroskopie konfokalnym Metissa Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss). Test aktywności PPAR. Komórki HEK293T wysiane na 48-studzienkowych płytkach transfekowano pLNCX lub pLNCX- (HA) PMLIV w połączeniu z reporterem 3XPPRE-lucyferaza, PPARy, RXRy i P-galaktozydazy. Następnego dnia komórki traktowano WY14643 lub DMSO w obecności pożywki uzupełnionej 10% FBS. Po 16 godzinach traktowania, komórki poddano lizie i lizaty oznaczono pod względem aktywności lucyferazy i aktywności p-galaktozydazy (78).
[podobne: ospamox opinie, parapareza, alergolog kłodzko ]

0 thoughts on “medicus stomatolog”