Skip to content

jakie dobre białko na mase

2 miesiące ago

43 words

H5N1 rozmnażano w jajach kurzych przez 2 dni, a inne wirusy namnażano w konfluentnych komórkach MDCK. Po 2 dniach zmiany cytopatyczne były zakończone, a supernatanty z hodowli zebrano i oczyszczono przez wirowanie z małą prędkością i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Pep1-AP i peptyd kontrolny (odpowiednio, TFLLR-NH2 i FTLLR-NH2) zakupiono od Bachem. Antagonista PAR1 (dichlorowodorek SCH79797) zakupiono od Axon Medchem. PLG zakupiono od Sigma-Aldrich i zastosowano następujące przeciwciała: monoklonalne anty-HA (C102; Santa Cruz Biotechnology), monoklonalne anty-tubuliny (Sigma-Aldrich) i poliklonalne anty-ERK i fosfo-ERK (Cell Signaling Technology ). Stymulacja in vitro. Komórki A549 preinkubowano przez 5 minut z 40 .M PAR1-AP lub peptydem kontrolnym lub przez godzinę z 5 .M SCH79797. Komórki następnie zakażono H1N1 (MOI 0,001) w MEM uzupełnionym 0,5 .M PLG (Sigma-Aldrich) w obecności leku. We wskazanych czasach po stymulacji miana wirusa analizowano za pomocą klasycznych testów łysinkowych, jak uprzednio, stosując komórki MDCK (56). Analiza Western blot aktywacji ERK i cięcia HA. Komórki A549 lub NIH3T3 stymulowano lub nie za pomocą wskazanych stężeń PAR1-AP przez 5 minut w 37 ° C. Tam, gdzie to wskazano, komórki wstępnie inkubowano przez godzinę z SCH79797. Komórki następnie poddano lizie i białka z lizatu analizowano metodą Western blot w celu aktywacji ERK, jak opisano wcześniej (57). W doświadczeniach z cięciem HA komórki A549 stymulowano lub nie 40 .M PAR1-AP i infekowano IAV (MOI 0,5) przez 16 godzin w obecności lub nieobecności 0,5 .M PLG. Komórki następnie poddano lizie i białka z lizatu analizowano metodą Western blot, jak opisano wcześniej (57). Myszy. Plg. /. w tym badaniu wykorzystano myszy (z zaburzonym genem Plg) i ich myszy z miotową WT (58) i 6-tygodniowe samice myszy C57BL / 6 (Charles River Laboratories). Par1. /. myszy (z zaburzonym genem Par1) i ich współmałżonków z WT opisano wcześniej (59). Myszy heterozygotyczne krzyżowano i stosowano potomstwo WT i KO. Wiek myszy wynosił od 5 tygodni do maksymalnie 4 miesięcy, ponieważ liczba myszy, które można było uzyskać, była ograniczona. W doświadczeniach stosowano samce i samice myszy. Grupy myszy WT i KO poddano stratyfikacji pod względem tych różnic wieku i płci. Przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy DNA genomowego końca ogona (60) w celu określenia nieobecności lub obecności funkcjonalnego genu Plg lub Par1. Infekcja i leczenie myszy. Myszy znieczulano i inokulowano donosowo 25 .l roztworu zawierającego różne dawki wirusa w obecności lub nieobecności 50 .M PAR1-AP, 50 .M peptydu kontrolnego i / lub 50 .M SCH79797. 500. M SCH79797 zastosowano również do blokowania eksperymentów na Figurze 4B. Leczenie donosowe za pomocą PAR1-AP, peptydu kontrolnego i / lub SCH79797 również powtórzono w dniach 2 i 3 po zakażeniu. Alternatywnie, myszy zaszczepiono, a SCH79797 podawano w dniach 2. 4 lub dniach 3. 5 po zakażeniu. Myszy następnie monitorowano pod względem utraty wagi i śmiertelności. W celu oceny replikacji wirusa, płuca uzyskano od ziaren myszy, a miana zakaźnych wirusów określono za pomocą testu łysinkowego, jak opisano wcześniej (56). Wykrywanie cytokin przez ELISA i rekrutację PMN. Wytwarzanie cytokin RANTES, IL-6 i KC w płucach określano za pomocą ELISA (R & D Systems), stosując BAL z myszy, jak opisano wcześniej (60). W celu rekrutacji PMN, BAL zebrano w PBS (Invitrogen) uzupełnionym mM EDTA (Invitrogen). Po cytowirowaniu, procent PMN określono przez zliczenie w sumie 500 komórek na próbkę za pomocą badania mikroskopowego May-Grünwald. i szkiełka cytotencjalne wybarwione Giemsa. Histologia płuc
[podobne: guzek na podniebieniu, objaw lasegue a, czy sepsa jest zaraźliwa ]

0 thoughts on “jakie dobre białko na mase”